Daraxonrasib (RMC-6236) RAS-IN-2 CAS#2765081-21-6体内体外试验方法，多靶点KRAS、NRAS、HRAS抑制剂

原创 DKM DKM中国

3天前

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靶点及简介

RAS-IN-2是一种有效的RAS(ON)MULTI抑制剂,可用于癌症研究。

RMC-6236（Daraxonrasib）是一种 RAS(ON) 多选择性非共价抑制剂，作用于典型 RAS 异构体的突变型和野生型变体的活性 GTP 结合状态，具有广泛的抑制作用和治疗潜力。 RMC-6236 在 RAS 成瘾细胞系中表现出强大的抗癌功效，尤其是那些在 KRAS 密码子 12 处发生突变的细胞系。Daraxonrasib (RMC-6236) 是一种口服活性、非共价的 RAS(ON) 多选择性抑制剂，它对野生型 KRAS、NRAS、HRAS 及多种致癌 RAS 变体 EC50值在 28-220 nM 之间[1]。Daraxonrasib并非直接与 RAS 结合，通过与细胞内伴侣蛋白CypA结合，并与RAS(ON)形成三元复合物，从而阻断RAS与下游效应蛋白（如RAF）的相互作用，这一机制为广谱靶向RAS(ON)提供了新的可能性，标志着癌症治疗领域的重大突破[2]。

体外活性

使用Daraxonrasib (RMC-6236)（1，3，10，30nM，4小时）处理HPAC 和 Capan-2 细胞系，进行WesternBlot分析。

结果：Daraxonrasib (RMC-6236) 处理的 HPAC 和 Capan-2 细胞系中观察到 RAS 通路信号标志物 pERK 、 pAKT 和 pS6 的时间和浓度依赖性抑制，在 Capan-2 中对 pERK 和 pS6 的持续抑制至少长达 48 小时；HPAC 细胞还表现出持续的 pERK 抑制和细胞凋亡的时间依赖性诱导。[1]

1. 细胞增殖与活力检测 (Cell Proliferation & Viability)

评估RMC-6236对肿瘤细胞生长抑制作用的核心方法是CellTiter-Glo发光法细胞活力检测。实验通常在96孔或384孔板中进行。将携带不同RAS突变（如KRAS G12V的Capan-1、KRAS G12C的NCI-H358、KRAS G12D的AsPC-1等）或野生型RAS的肿瘤细胞系接种过夜。次日，使用不同浓度的RMC-6236（溶于DMSO）处理细胞，并持续培养120小时（5天）。培养结束后，加入CellTiter-Glo 2.0试剂，通过检测发光信号来定量细胞内的ATP水平，从而反映活细胞数量。根据剂量-反应曲线，计算得到半数最大效应浓度（EC₅₀）值，用以评估药物的细胞生长抑制效力。对于大规模细胞系筛选（如PRISM Assay），则通过检测独特的DNA条形码来评估药物对混合细胞池中各细胞系的敏感性。

2. 信号通路抑制分析 (Signaling Pathway Inhibition)

为验证RMC-6236对RAS下游信号通路的抑制效果，主要采用Western Blot、AlphaLISA或Meso Scale Discovery (MSD)等技术检测通路关键蛋白的磷酸化水平。将细胞（如HPAC、Capan-2）处理不同浓度RMC-6236一定时间后（如4小时、24小时），收集细胞裂解液。通过Western Blot检测pERK (T202/Y204)、pAKT (S473)、pS6 (S235/236)等蛋白的磷酸化水平及其总蛋白水平。对于高通量检测，则使用AlphaLISA或MSD免疫分析法定量检测pERK水平，以此评估药物对MAPK通路的抑制程度和EC₅₀值。

3. 生化抑制活性评估 (Biochemical Inhibition)

在无细胞的生化系统中，为验证RMC-6236直接作用于RAS-效应蛋白相互作用的机制，采用了时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）分析。该实验体系包含重组的RAS蛋白（多种突变型或野生型）、BRAF蛋白的RAS结合域（RBD）以及亲环蛋白A（CypA）。通过检测RMC-6236对RAS-BRAF相互作用的破坏程度，评估其生化抑制活性(IC₅₀)。

注：本文献方法总结仅供科研参考，具体实验条件（如细胞密度、试剂浓度、孵育时间等）需根据实际情况进行优化。

体内活性

使用Daraxonrasib (RMC-6236)（3,10,25mg/kg ，口服）治疗Capan-2 异种移植荷瘤小鼠，评估了RMC-6236 的药代动力学（PK）和药效学（PD）特征以及体内一系列突变 RAS 驱动的人肿瘤异种移植模型中的抗肿瘤活性。

结果：Daraxonrasib (RMC-6236) 在多种异种移植模型中表现出相似的 PK 曲线，并且在重复给药后不会在血液和肿瘤中积累；RMC-6236 在各种异种移植肿瘤中的暴露量比血液中的暴露量高约 3 至 7 倍，并且从肿瘤中清除的速度相对较慢；与异种移植肿瘤中的剂量依赖性和长期暴露一致，口服 RMC-6236 导致 RAS 通路信号传导的剂量依赖性和持久抑制。[1]

1. 皮下异种移植瘤模型 (Subcutaneous Xenograft Models)

为评估RMC-6236的体内抗肿瘤活性，主要使用皮下异种移植瘤模型。将携带特定RAS突变的人类肿瘤细胞（如PDAC来源的MIA PaCa-2, HPAF-II；NSCLC来源的NCI-H441, NCI-H1373等）悬液皮下接种于免疫缺陷小鼠（如BALB/c裸鼠或NOD-SCID鼠）的右胁腹部。待肿瘤生长到特定体积（如130-200 mm³）后，对小鼠进行随机分组，开始给予RMC-6236或溶剂对照。给药方式为每日一次口服灌胃（p.o., qd），剂量范围通常为3 mg/kg至25 mg/kg。在治疗期间，每周两次使用卡尺测量肿瘤体积（计算公式: V = (长×宽²)/2）并监测小鼠体重以评估药物耐受性。治疗周期通常为28天或更长，以评估长期疗效和反应持久性。

2. 药代动力学/药效学 (PK/PD) 分析

在单次或重复给药后，于不同时间点（如2, 8, 24, 48小时）收集小鼠的血液和肿瘤组织样本。使用LC-MS/MS方法检测样本中RMC-6236的浓度，以分析其药代动力学（PK）特征。同时，提取肿瘤组织的RNA，通过RT-qPCR检测RAS通路下游靶基因DUSP6的mRNA表达水平，以此作为药效学（PD）的生物标志物。通过建立药物暴露浓度与靶点抑制之间的PK/PD模型，可以预测驱动肿瘤消退所需的药物浓度和给药方案。

3. 特殊动物模型研究

原位颅内移植模型 (Orthotopic Intracranial Model): 为研究药物对脑转移的疗效，将带有荧光素酶标记的肿瘤细胞（如LU99-Luc）立体定向注射到小鼠颅内。通过活体生物发光成像（BLI）监测颅内肿瘤的生长情况，并评估RMC-6236的治疗效果。

同源肿瘤模型 (Syngeneic Model): 在免疫功能健全的小鼠（如BALB/c）体内接种鼠源性肿瘤细胞（如eCT26, 携带Kras G12C突变），用于研究RMC-6236对肿瘤免疫微环境的影响，并评估其与免疫检查点抑制剂（如anti-PD-1）的联合用药效果。通过流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞（如CD4+/CD8+ T细胞）的变化。

基因工程小鼠模型 (GEMM): 通过在小鼠肺部诱导表达多种特定Kras突变的肿瘤，来平行比较RMC-6236对不同RAS突变亚型肿瘤的治疗效果。

注：所有动物实验均应遵循机构动物保护与使用委员会（IACUC）的规定。

参考文献：

1）.Jiang J, et al. Translational and Therapeutic Evaluation of RAS-GTP Inhibition by RMC-6236 in RAS-Driven Cancers. Cancer Discov. 2024 Jun 3;14(6):994-1017.

2）.Holderfield M, et al. Concurrent inhibition of oncogenic and wild-type RAS-GTP for cancer therapy. Nature. 2024 May;629(8013):919-926.

溶解度及制备方案